纳米Ag-SiO2导尿管对人体外尿道黏膜细胞的毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (16): 2550-2556.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.015

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纳米Ag-SiO₂导尿管对人体外尿道黏膜细胞的毒性

张展¹，刘春²

¹山西医科大学，山西省太原市 030001；²山西医科大学第一医院，山西省太原市 030001

修回日期:2014-02-16 出版日期:2014-04-16 发布日期:2014-04-16
通讯作者: 刘春，主任医师，硕士生导师，山西医科大学第一医院，山西省太原市 030001
作者简介:张展，男，1987年生，河南省周口市人，山西医科大学在读硕士，主要从事泌尿系疾病的研究。
基金资助:
山西省自然科学基金资助项目(2006011119)

Cytotoxicity evaluation of nano-Ag-SiO₂urethral catheter for external urethral mucosa cells

Zhang Zhan¹, Liu Chun²

¹Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Revised:2014-02-16 Online:2014-04-16 Published:2014-04-16
Contact: Liu Chun, Chief physician, Master’s supervisor, First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Zhang Zhan, Studying for master’s degree, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 2006011119

摘要/Abstract

摘要：

背景：纳米Ag-SiO₂导尿管抗菌作用突出，明显减少了长期留置尿管所致的泌尿系感染。在追求纳米银医疗产品优异抗菌性的同时，人们也越来越重视其生物安全性。

目的：将人前列腺部尿道上皮细胞置于纳米Ag-SiO₂导尿管浸提液中培养，评价纳米Ag-SiO₂导尿管的生物学安全性。

方法：分别以普通导尿管浸提液、纳米Ag-SiO₂导尿管浸提液及普通细胞培养液培养前列腺增生症患者前列腺部尿道上皮黏膜细胞，培养2，5，7 d，通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)，用酶标仪测定各培养间期各组体外细胞的吸光度值，计算细胞相对增殖率，同时通过倒置显微镜观察细胞的形态、生长和增殖情况，定量和定性地进行毒性评价及比较。

结果与结论：纳米Ag-SiO₂导尿管浸提液细胞毒性为1级，普通导尿管浸提液细胞毒性为0、1级，细胞相对增殖率组别效应无统计学差异(F=0.544，P=0.475)；细胞相对增殖率时间效应有统计学差异(F=3.031，P=0.086)；组间与时间之间交互作用无统计学差异(F=0.130，P=0.879)。结果表明纳米Ag-SiO₂导尿管对不同培养间期细胞的生长繁殖影响微弱，符合医疗器械生物学评价标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 纳米材料, 纳米Ag-SiO₂, 尿道上皮细胞, 导尿管, 安全性, 四甲基偶氮唑盐, 山西省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Nano-Ag is increasingly used as antibacterial materials in medical products due to its excellent antibacterial activity. Antibacterial activated nano-Ag-SiO₂ urethral catheter can reduce the incidence of catheter-associated urinarytract infections obviously. As more and more nano-Ag medical products have been developed, their biological security is becoming a focused issue.

OBJECTIVE: To evaluate the biosecurity of nano-Ag-SiO₂ urethral catheter through comparing the active influence of nano-Ag-SiO₂ urethral catheter and ordinary urethral catheter extracts on in vitro cells of human prostatic urethra epithelial cells in different periods.

METHODS: Mechanical separation and enzymatic digestion were used to isolate and culture urothelial mucosa of benign prostatic hyperplasia patients to make cell suspension after proliferation in vitro. The medium was replaced by nano-Ag-SiO₂ and general catheter tube extracts, respectively. MTT assay was performed to quantify the in vitro cytotoxicity of two extracts on human urethra epithelial cells which were cultured for 2, 5 and 7 days. Absorbance values of nano-Ag-SiO₂ and general urinary catheter groups were measured by enzyme-linked immunosorbent assay to calculate the relative growth rate, and toxicity evaluation was compared and evaluated. Under an inverted microscope, cell morphology, growth and proliferation were observed.

RESULTS AND CONCLUSION: The cytotoxicity of extract of nano-Ag-SiO₂ catheter was 1 grade, and that of general medical catheter extract was 0 to 1 grade. There was no statistical difference in group effect of relative proliferation rate (F=0.544, P=0.475); there was statistical difference in time effect of relative proliferation rate (F=3.031, P=0.086); no statistical difference was found in the interaction between group and time (F=0.130, P=0.879). These findings indicate that nano-Ag-SiO₂ catheter has no or low cytotoxicity effect on cell growth and proliferation, which is consistent with the biological evaluation standards of medical devices.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, nanoparticles, urothelium, silicon dioxide

中图分类号:

R318

张展，刘春. 纳米Ag-SiO₂导尿管对人体外尿道黏膜细胞的毒性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(16): 2550-2556.

Zhang Zhan, Liu Chun. Cytotoxicity evaluation of nano-Ag-SiO₂urethral catheter for external urethral mucosa cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(16): 2550-2556.

图/表（结果） 3

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引言

银作为抑菌剂已被人们广泛应用于临床，与其他金属相比，银具有极低的有效抑菌浓度，抗菌性强、毒性小，在体内难以蓄积。而抗菌材料的发展很大一部分原因是由于细菌感染经常导致人类患病，因此越来越多的抗菌材料被研制出来，其中一些抗菌材料是在纳米尺度运用特定的技术与方法研制的，被称为纳米抗菌材料，其与抗菌载体结合后抗菌性能更加优异^[1-2]。随着科技的进步，出现了越来越多的纳米抗菌材料，而且已被广泛应用在建筑、电子、纺织品、医疗等方面^[3-4]。

纳米银因具有优越的性能，被广泛应用于化工、光学、超导、电子、医学等行业，应用前景广阔^[5-8]。纳米银具有优异的抗菌性，被广泛应用于医疗方面，如医用手套、医用无纺布、医用床单、口罩、消毒用品等，除了广谱抗菌特性外，其还具有渗透性、强杀菌性，重复性好，安全无毒，抗菌持久，耐洗性，不易耐药等特点。一般认为纳米银的抗菌原理是由于带正电的银离子从金属银中进入其表面水层，与细菌细胞膜中磷脂分子的磷酸根相互吸引，改变细菌细胞膜蛋白结构，从而损伤细菌^[9]。另外，细菌中的氧代谢酶与银离子结合失去活性，使细菌死亡^[10]。纳米银独特的抗菌原理可以快速杀死细菌，使其无法进行下一代繁殖，可以避免耐药性。纳米银对革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌等均有抗菌作用，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、桔青菌等^[11]。然而由于纳米银的低分散稳定性、高的表面能而易团聚，极大限制了其在抗菌材料中的应用^[12]。银粒子的抗菌性主要与其粒径大小、稳定性两方面有关。将纳米银颗粒载于合适的载体上，通过对其改性和修饰，提高其与细菌间反应的持久性、抗菌稳定性，同时缓慢的释放纳米银，可以提高其抗菌性，拓宽抗菌范围^[13-15]。通过研究发现，SiO₂具有热稳定性、化学稳定性、无毒、亲和性好、表面积大等特点，以SiO₂为载体将纳米银颗粒载于其上，研制出新型抗菌材料纳米Ag-SiO₂，其不仅具有优异的广谱抗菌活性，同时在载体SiO₂作用下，可以持久、缓慢的释放纳米级银离子，由于其特有的表面效应和小尺寸效应，破坏微生物的DNA分子、屏障结构及酶活性^[16-17]，从而杀死微生物，纳米银离子使菌体失活后，从菌体中出来，进入下一个菌体，如此反复进行杀菌。与纳米银相比，纳米Ag-SiO₂抗菌性更加稳定、持久，可有效预防细菌、真菌等微生物的感染，纳米Ag-SiO₂也越来越多的作为长效抗菌剂被人们应用。

导尿管是临床治疗上不可或缺的医疗器械，但在人体内容易引起细菌驻留，诱发感染，医院感染病例中约40%为留置导尿管所致的泌尿系感染，仅次于呼吸道感染^[18]。患者在留置导尿管的同时几乎都会发生感染，而纳米Ag-SiO₂导尿管具有优异的抗菌性，可以显著减少导尿管相关性尿路感染的发生率^[19]。

随着纳米Ag-SiO₂导尿管被研制出来，在充分利用纳米Ag-SiO₂抗菌作用的同时也应该重视其生物安全性。实验采用纳米Ag-SiO₂导尿管浸提液和普通导尿管浸提液分别对人前列腺部尿道黏膜细胞进行培养，以评价纳米Ag-SiO₂导尿管的生物安全性。

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材料方法

设计：纳米Ag-SiO₂导尿管的体外细胞毒性实验。

时间及地点：于2013年4至11月在山西医科大学科研实验中心完成。

材料：

实验标本：经患者及其家属同意，与其签署知情同意书后，于经尿道前列腺电切术中取数块前列腺增生症患者前列腺段0.5 cm×0.4 cm尿道黏膜，用于提取尿道上皮细胞。

实验方法：

培养液的制备：DMEM/F12、体积分数10%胎牛血清、胰岛素5 mg/L、转铁蛋白5 mg/L、腺嘌呤25 mg/L、表皮细胞生长因子20 μg/L、地塞米松1 mg/L、L-谷氨酰胺584 mg/L、两性霉素B 1 mg/L、青/链霉素100 000 U/L，0.2 μm滤膜过滤除菌^[20]。

浸提液的制备：分别随机截取普通医用导尿管和纳米Ag-SiO₂导尿管数段，按照材料质量与培养液比例为0.2 g/mL，在体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中浸提24 h，取出材料，所得液体为浸提液，用于细胞毒性实验^[21]。

人尿道上皮细胞的制备：取出大小约0.5 cm×0.4 cm尿道黏膜后，放入含有青/链霉素100 000 U/L、两性霉素B 1 mg/L的DPBS液中，于冰盒内迅速送至实验室，用上述DPBS液洗涤标本后，放入2.24 U/mL DispaseⅡ酶中， 4 ℃消化过夜，第2天用眼科镊小心将黏膜与黏膜下层分离并揭下，剪碎后置于0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液中，于37 ℃下振荡消化5 min，终止消化后用吸管吹打后以100目细胞筛过滤，滤液移至离心管1 000 r/min离心5 min，离心半径8.9 cm，弃上清液，加入培养液，吹打混悬，细胞计数后，以5×10⁷ L^-¹的浓度接种于24孔培养板内，置 37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，24 h后换液去除未贴壁细胞，以后每隔2 d换液，细胞生长融合至90%时以1∶2传代。在倒置显微镜下观察细胞形态、生长和增殖情况^[20^、^22]。

分组：将人尿道上皮细胞分组培养，实验组采用纳米Ag-SiO₂导尿管浸提液培养，对照组采用普通医用导尿管浸提液培养，空白组采用混合培养液培养。

细胞接种：取原代细胞，将制备的人尿道上皮细胞悬液以5×10⁷L^-¹的浓度接分别种于3个96孔培养板的2，3，4列，200 μL/孔，将200 μL培养液加入1，5列中。置于体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，24 h后换液去除未贴壁细胞，第2，3列分别加入200 μL纳米Ag-SiO₂导尿管(实验组)及普通医用导尿管浸提液(对照组)，第4列加入200 μL培养液(空白组)，3个96孔培养板分别继续培养，培养间期为2，5，7 d。

尿道上皮细胞的定性评价：细胞悬液中细胞为类圆形且体积较小，24 h后，大部分细胞贴壁，细胞突起伸展，呈多角形，体积较贴壁前增大，3 d后细胞增殖速度加快，6 d时细胞呈散在的簇片状分布，9 d后细胞长满培养孔，如铺路石状，大小均一，进行传代，第2-4代细胞与原代细胞无明显差别，形态良好^[23]。

尿道上皮细胞的MTT比色：分别在培养间期2，5，7 d三个时间点进行MTT比色，对含有细胞的各孔换培养液，200 μL/孔，在第2-4列B-G孔中各加入浓度为5 g/L MTT，40 μL/孔，继续培养4 h。小心吸除孔内培养液，于各孔中加入二甲基亚砜，200 μL/孔，于振荡箱中低速振荡15 min，结晶充分溶解，在酶标仪吸光度490 nm处，测定各孔吸光度值(A)，上述实验过程共重复3次。

尿道上皮细胞相对增殖率：分别以纳米Ag-SiO₂导尿管浸提液组和普通导尿管浸提液组的A值作为实验组A值，以普通培养液组的A值作为阴性对照组A值，以公式细胞相对增殖率=实验组A/阴性对照组A×100%来计算各培养间期、各组的细胞相对增殖率。

细胞毒性评价：依据GB/T16886.5细胞毒性实验进行毒性分级，细胞相对增殖率>100%为0级，细胞相对增殖率75%-99%为1级，0或1级时导尿管为合格；细胞相对增殖率50%-74%为2级，此时导尿管的细胞毒性要结合细胞形态进行综合评价；细胞相对增殖率25%-49%为3级，细胞相对增殖率1%-24%为4级，3级或4级时导尿管为不合格^[24]。

主要观察指标：各组细胞生长曲线、细胞形态和细胞相对增殖率。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件，采用多因素析因设计方差分析，检验水准为0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

实验根据既往研究报道培养人前列腺部尿道上皮细胞。消化培养法能将妨碍细胞生长的细胞间质除去，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸取养分和排出代谢产物。在原代就可以使细胞得以基本纯化，得到的活细胞数量较多。分离上皮时首先采用DispaseⅡ，该酶是一种提取自多黏杆菌、作用温和的分离上皮与真皮的中性蛋白酶；作用于基底膜，选择性地分解纤维连接素和Ⅳ型胶原，而保存上皮细胞活力及细胞连接^[25]。与胰蛋白酶相比，DispaseⅡ只是将上皮分离而不分解单个角化细胞，在保留上皮细胞活力与连接的同时将上皮层与上皮下层自基底膜处完全分离。对于上皮细胞间的分离，实验采用混合消化酶(0.25%胰酶-0.02%EDTA)消化法。使用DMEM与F12 1∶1混合培养液加体积分数为10%的胎牛血清，对尿道上皮细胞尝试原代单纯培养。体积分数为10%的胎牛血清除了提供细胞生长的营养成分外，还能促进细胞DNA合成，含有细胞增殖所必需的生长因子。该混合培养液中还含有转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子、腺嘌呤和地塞米松等多种细胞生长必需的养分。实验结果表明，上皮细胞生长状态良好，增殖较快。实验发现所培养的细胞为类圆形，大小均一，如铺路石状密集排列，胞核大，符合尿道移行上皮细胞形态特点。

男性尿道的组织结构：男性尿道的尿道膀胱段与前列腺部、膜部和海绵体部3段的组织结构有所不同。管壁可分为黏膜、黏膜下层和肌层。前列腺部的黏膜上皮与膀胱相似，为移行上皮。膜部和海绵体部则为复层或假复层柱状上皮，近舟状窝处移行为复层扁平上皮并与阴茎头的鳞状上皮相连^[26]。实验证实纳米Ag-SiO₂导尿管对人体外前列腺部尿道黏膜细胞毒性影响轻微，对其他段尿道黏膜细胞的毒性还有待进一步证实。

当病原微生物被抗菌剂杀死时，抗菌材料会对人体细胞造成一定的毒副作用。细胞毒性实验作为生物安全评价不可或缺的部分，是评价生物材料对细胞的毒性影响的方法，是应用于临床前的必要评价^[27-28]，营造了细胞与生物体外的生长环境。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)作为其中检测方法，已被广泛应用，线粒体作为细胞能量供应的工厂是该法测定的生物学终点，在细胞代谢旺盛或者增殖时增加，反之减少，可以客观反映损害细胞的程度，MTT法基本原理是四甲基偶氮唑盐仅被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的甲瓒结晶，再将结晶溶于二甲基亚砜中，在酶标仪吸光度490 nm处测定吸光度值，由于结晶仅在活细胞中形成，因此细胞的数量和活性能通过吸光度值量化。MTT比色法检测结果灵敏度高、特异性强、快速、准确且重复性好，操作简便，节省材料，对仪器要求不高，无同位素污染。该方法符合作为一种良好的细胞毒性检测方法^[29]，因此，实验采用了MTT比色法来评价纳米Ag-SiO₂导尿管的体外细胞毒性。

随着科技的发展，纳米技术得到了越来越广泛的应用，纳米银作为一种新型的抗菌材料，与普通抗菌材料相比抗菌能力更强，是由于其释放银离子更加的缓慢，同时还具有无耐药性的特点，被广泛应用到了医疗产品中。而大部分产品都会直接与人体接触，应该考虑纳米银抗菌材料对接触细胞的毒性，有研究对不同纳米银产品细胞毒性进行比较，其细胞毒性有很大差异，造成这一现象的原因是由于不同纳米银产品应用的纳米银颗粒形态、尺寸大小和剂量等各不相同。由于纳米银颗粒进入细胞内较容易，与细胞器(线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体等)内生物大分子吸引并结合，造成其结构发生变化，从而损伤细胞，其具体毒性机制可能主要是氧化应激介导所致细胞损伤和细胞膜损伤两部分，通过纳米银颗粒对一些细胞毒性的研究发现，当细胞与其接触时，细胞内线粒体的功能会丧失或显著降低，这是造成细胞死亡的关键因素。通过研究发现，纳米银颗粒使细胞内活性氧增加的同时使谷胱甘肽耗竭，从而造成细胞线粒体功能的紊乱^[30-31]，银离子与细胞线粒体内的巯基反应而形成细胞毒素，从而降低谷胱甘肽水平，细胞线粒体与银离子接触导致其氧化应激。这一毒性机制与纳米银颗粒的抗菌机制相互应对，都是通过与巯基吸引并结合而实现的，当纳米银与巯基蛋白或酶吸引并结合后，使超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽等蛋白或酶结构发生变化，从而失去活性，导致细胞抵抗氧化损伤能力降低，由于大量的活性氧无法被这些蛋白或酶中和，活性氧在细胞内不断蓄积，引起细胞的炎症反应，使线粒体功能丧失，促使细胞凋亡因子释放，造成细胞死亡。纳米银颗粒对于细胞膜的损失也是如此，巯基蛋白质大量存在于细胞膜上，当与纳米银颗粒吸引并结合后，蛋白结构发生改变，使细胞膜损失。虽然纳米银具有优异的抗菌性，但其独特的性质使其毒副作用也很特殊。由于纳米银颗粒会出现团聚现象，使其失去纳米特性，当通过载体修饰纳米银时其抗菌效果得到了更加有效的体现，抗菌性较纳米银更加的稳定、持久，由于纳米载银无机抗菌剂更加的稳定，其细胞毒性也逐渐成为了关注的重点。研究发现不同的载体使其细胞毒性不同，但其细胞毒性较小，较为安全^[32]。纳米Ag-SiO₂作为纳米载银无机抗菌剂中的一种，因其具有优异的抗菌性和稳定性，越来越多的被应用于医疗产品，但在一味追求抗菌效果时也不能忽视对人体的不良反应。

银离子对光和热较为敏感，容易被氧化或生成单质银。纳米银作为抗菌材料，已被广泛的应用于临床医疗器材，具有纳米银涂层的导尿管也已被应用于临床。新型抗菌材料纳米Ag-SiO₂结构独特，既保留了纳米银的抗菌能力，非晶硅壳又防止了内核的银被氧化，使其抗菌作用更加显著、稳定，是一种良好的抗菌材料^[33-38]。本课题组前期选用该抗菌材料涂层于导尿管上，研制出纳米Ag-SiO₂导尿管，并对其抑菌性进行了实验，结果表明，与普通导尿管相比较，纳米Ag-SiO₂导尿管抑菌作用更加显著，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌性良好^[39]。进一步的动物实验也表明，纳米Ag-SiO₂导尿管抗菌效果显著^[40]，但在看到其具有抗菌高效性的同时还要关注其生物安全性。对于纳米尺度的生物效应，尤其是毒理学与安全性问题，课题组前期通过对兔尿道上皮细胞的培养实验表明，纳米Ag-SiO₂导尿管具有良好的生物安全性，对细胞的生长繁殖影响微小^[41]，但纳米Ag-SiO₂导尿管对于人体外尿道黏膜细胞的细胞毒性影响尚不清楚。纳米Ag-SiO₂属于纳米级抗菌材料，具有特殊的生物效应，所以一般研究其安全性与毒理学主要从整体、细胞、分子3个方面入手，实验主要从细胞方面进行了研究。

相对于培养动物细胞，实验原代细胞来源于人，可以更好地反映人的尿道上皮细胞特性。实验通过对人前列腺部尿道黏膜细胞的体外培养，发现在不同时间段纳米Ag-SiO₂导尿管对细胞的生长和繁殖影响轻微，具有良好的生物安全性，客观的为纳米Ag-SiO₂导尿管应用于临床提供实验依据。人体内与体外的生化环境不同，纳米Ag-SiO₂导尿管的体内毒性还需进一步深入研究。

结论：纳米Ag-SiO₂导尿管和普通导尿管一样，均对人体外前列腺部尿道上皮细胞不同培养间期的生长繁殖有影响，但均影响轻微，与医疗器械生物学评价标准相符合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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纳米Ag-SiO₂导尿管对人体外尿道黏膜细胞的毒性

Cytotoxicity evaluation of nano-Ag-SiO₂urethral catheter for external urethral mucosa cells

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